尊龙凯时·(中国)人生就是搏!

一、尊龙凯时细胞生物学团队介绍

由于免疫相关实验的多样性和复杂性，基于实验目的，我们还提供针对特定需求的实验方法开发和优化，可以最大程度帮助客户找到合适的筛选和评价体系。

1、JAK-STAT介绍

Janus激酶（The Janus kinase，JAK）以及信号转导和转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）通路是一种进化上保守的跨膜信号转导机制，保证细胞与外部环境的通信能够正常进行。各种细胞因子、干扰素、生长因子和其他特定分子都可以激活JAK-STAT信号，驱动一系列的生理和病理过程，包括增殖、代谢、免疫反应、炎症和恶性肿瘤等。然而JAK-STAT信号通路以及相关的基因突变与免疫异常激活和癌症的进展有着密切的关系。通过对JAK-STAT通路的结构和功能的深入研究，目前已经出现多种临床药物并被获批用于疾病的治疗，主要针对细胞因子及其受体，以及JAK和STAT。JAK-STAT的异常功能与各种自身免疫病有着密切的关系，也是治疗各种疾病的潜在靶点。

1.1JAK家族：

非受体酪氨酸激酶的JAK家族由四种蛋白组成：JAK1、JAK2、JAK3和TYK2，均为介导细胞因子信号转导的细胞内蛋白。JAK蛋白由FERM、SRC同源结构域（SH2）、假激酶和激酶结构域组成。FERM和SH2结构域主要负责JAK与受体的结合；假激酶结构域调节激酶结构域的活性，这对受体酪氨酸的磷酸化至关重要，从而导致下游分子的进一步磷酸化。受体与配体形成复合物进而激活受体结合的JAK，进而催化受体酪氨酸的磷酸化。JAK家族的四个已知成员每个都与特定的细胞因子受体相互作用，并招募相应的STAT来发挥不同的生物学功能。JAK1、JAK3和TYK2负责免疫系统的发育和免疫调节，而JAK2则主要参与造血功能。

1.2 STAT家族：

STAT蛋白是JAK下游的信号分子，包括STAT1，STAT2，STAT3，STAT4，STAT5和STAT6共计6个家族成员。STAT由N端的结构域、DNA结合结构域、连接结构域、SH2结构域和一个转录激活结构域组成。N端结构域促进了STAT二聚体的形成；螺旋结构域调控着入核；DNA结合域能够与DNA结合作为转录因子。SH2结构域识别特定细胞因子受体上的磷酸化酪氨酸。受体酪氨酸被磷酸化后，胞质STAT被招募到激活的受体，进而STAT酪氨酸被磷酸化，导致STAT二聚体的形成，然后，STAT二聚体作为一个组成部分进入细胞核形成转录因子复合物促进特定靶基因的转录。JAK-STAT激活在疾病中发挥双重作用。JAK-STAT通路的过度激活与许多疾病的不良预后有关，包括常见的自身免疫病类风湿性关节炎、结肠炎等以及癌症如前列腺癌、乳腺癌和肺癌等。

图1 A，JAK结构域；B，STAT结构域。10.3389/fimmu.2017.01758

1.3 JAK抑制剂的研究现状

自从九十年代初JAK蛋白被发现以来，人们对其的研究就没有停止过，并且发现其与各种自身免疫病都存在着密切的关系，这也导致了第一个JAK抑制剂Tofacitinib的诞生，同时Tofacitinib也是一款非选择性的JAK抑制剂，对JAK1/2/3均有一定的抑制作用。类似的非选择性还包括Ruxolitinib、Tofacitinib、Baricitinib、Peficitinib和 Momelotinib等，这类药物是目前临床上应用最为广泛的一类JAK抑制剂，在治疗免疫性疾病方面较为成熟，被认为是第一代JAK抑制剂。此外，选择性JAK分子抑制剂，也就是第二代JAK抑制剂的开发近年来受到了广泛的关注，这类药物能显著降低不良反应，针对性的治疗相关疾病，改善患者的临床症状，代表性的抑制包括JAK1抑制剂Upadacitinib、Filgotinib、Abrocitinib、Itacitinib等；JAK2抑制剂Fedratinib、Pacritinib等；JAK3抑制剂Ritlecitinib、Decernotinib等；其中选择性Tyk2抑制剂BMS-986165的发现也给药物的研究提供了新的方向。

目前针对第二代JAK抑制剂的药物设计主要包括三个方向：一是靶向JH1激酶区域的ATP结合位点；二是靶向JH2假激酶区域，BMS-986165就是典型的代表；三是靶向JAK3催化结构域中的Cys909残基同样具有较大的优势。

临床前的常规药物筛选为潜在药物筛选提供了有利的保证，针对JAK-STAT相关的化合物活性检测，目前ICE已经构建了从早期的生化检测到体外细胞功能测试再到动物模型的药效分析一整套的实验方案，助力推动新药的快速发现和推进。

2、尊龙凯时 JAK-STAT筛选平台介绍2.1 JAK-STAT抑制剂生化检测平台

每个JAK酶都包含一个ATP结合域，这对它们的功能至关重要，结合域内的ATP，提供JAK活性内在的磷酸基。虽然结构相似，但每个JAK都有一个细微的不同的ATP结合域。在人类基因组中有超过500种酪氨酸激酶，每种激酶都有相关的作用模式，并拥有一个ATP结合域。这些酶的抑制剂，通常通过阻碍ATP结合来发挥作用。由于ATP结合域在JAK之间有所不同，这对于发现具有高度选择性的JAK抑制剂具有重要的意义，基于此，尊龙凯时已经构建了JAK-STAT家族的各种酶学检测，用于早期抑制剂抑制活性的检测，如下：

图2 基于JAK的生化检测

图3 STAT3和STAT6的生化检测

 2.2 JAK-STAT抑制剂细胞学检测平台

细胞因子对体液和细胞免疫反应至关重要，与自身免疫性疾病相关的广泛的细胞因子，包括干扰素类（IFN）、白介素类（IL）和集落刺激因子，主要通过结合i型和ii型细胞因子受体的发挥多效性作用。i型和ii型细胞因子受体的相互作用可以激活JAKs，并随后招募STAT来转导来自细胞因子的信号。细胞因子诱导的JAK-STAT通路的激活在免疫细胞的分化和发育以及免疫系统的稳态中起着重要作用。如下是目前尊龙凯时免疫筛选平台基于JAK-STAT构建的各种实验的汇总：

表1 JAK-STAT相关检测汇总

图4 细胞因子与JAK-STAT激活信号通路示意图

2.2.1 Reporter assay

通过高通量筛选方式，在细胞水平检测各种酶抑制剂可以有效地筛选具有潜在活性的候选药物，基于细胞因子JAK-STAT之间特定的信号传导通路，尊龙凯时已经构建出基于不同的细胞因子受体，JAK1/2/3和STAT相关的报告基因细胞（reporter cell），可以有效地用于高通筛选信号通路相关抑制剂，包括细胞因子受体抑制剂，JAK1/2/3抑制剂以及STAT抑制剂等，同时，Hibit体系可以用于蛋白降解分子的筛选与验证，由于实验周期短，稳定性好，成为进行细胞功能性检测前的重要筛选手段之一。

图5 基于reporter细胞构建的JAK-STAT筛选实验

图6 针对STAT3和STAT6小分子和PROTAC的reporter 及Hibit筛选测试

2.2.2 细胞功能性检测

虽然reporter细胞可以高通量的进行筛选，但由于细胞之间的功能差异，因此针对性地在原代细胞或者特定疾病类型细胞上的进一步化合物活性验证，可以保证在体外筛选最佳的候选活性分子。由于各种自身免疫病的发生往往与一些免疫细胞的异常激活有着密切的关系，因此在原代免疫细胞上进行的抑制剂功能活性验证，可以更为针对性地筛选相关化合物。目前尊龙凯时基于细胞因子JAK-STAT在不同细胞上的激活差异，已经在各种免疫细胞和全血中建立相关的检测手段：

原代细胞检测：

图7 基于原代细胞的JAK-STAT功能性筛选实验

JAK-STAT全血相关检测：

图8 基于全血的JAK-STAT功能性筛选实验

下游细胞因子释放检测：

图9 JAK-STAT下游细胞因子检测

JAK–STAT信号通路的功能障碍和遗传变异与一系列血液恶性肿瘤和自身免疫性疾病密切相关，例如骨髓增生性肿瘤、急性淋巴细胞白血病、严重联合免疫缺陷、IBD、多发性硬化、银屑病和类风湿性关节炎等。尊龙凯时团队具有丰富的JAK-STAT通路研究经验，建立了完善的免疫相关JAK/STAT抑制剂筛选平台，旨在促进新药发现，促进新药研发进程。

撰稿人----刘朋、林亚茹

参考文献

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